1. Título o denominación de la actividad
 

Bases para el procesamiento e interpretación de muestras citológicas e histológicas.

 

2. Marco del curso y periodicidad:

Curso de posgrado en el marco de la carrera de Doctorado de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario. / Periodicidad bianual.

 

3. Directores: 

Dr. Fabricio Andrés Vigliano (Director)

Dr. Agustín Rinaudo (CoDirector)

 

4. Comité organizador:

M.V. Mauro Alaniz

Dr. Fabrisio Alustiza

M.V. Adolfo Araujo

Dra. Andrea Boaglio

M.V. Manuel Campana

Dr. Pablo Cerutti

Dra. Marina Dibarbora

M.V. Gabriela Guaragna

Dra. Jorgelina Manes

Tec. Sup. Hist. María Belén Mascambroni

Lic. Andrea Mendia Broda

Dr. Agustín Rinaudo

M.V. Sacha Emilio Santia

M.V. Caren Luciana Savia

M.V. Marcelo Tobin

M.V. Manuel Alejandro Roca

Dr. Fabricio Vigliano

 

5. Equipo docente:

Méd. Vet. Mauro Alaniz

Méd. Vet. Manuel Campana

Dr. Pablo Adolfo Cerutti

Dra. Marina Dibarbora

Méd. Vet. Gabriela Guaragna

Tec. Sup.  Histotecnología María Belén Mascambroni

Lic. Andrea Mendia Broda

Dr. Agustín Rinaudo

Méd. Vet. Sacha Emilio Santia

Méd. Vet. Caren Luciana Savia

Dr. Fabricio Andrés Vigliano 

 

6. Lugar de realización:

Pabellón 18. Facultad de Ciencias Veterinarias – U.N.R.

 

7. Modalidad Pedagógica:

El curso está estructurado intercalando el dictado de clases teóricas y prácticas. En las primeras tendrán un formato expositivo-dialogado y en ellas se brindarán los fundamentos para una correcta toma y remisión de muestras, procesamiento de las mismas, los principios fisicoquímicos que sustentan la histoquímica e inmunohistoquímica y los alcances de la citología como herramienta diagnóstica. Estas clases tendrán carácter presencial con posibilidad de dictarse en modalidad de aula híbrida, tanto para docentes como asistentes al curso. En las prácticas los cursantes podrán adquirir entrenamiento en las técnicas mencionadas en el Laboratorio de Inmunohistoquímica, las cuáles serán exclusivamente presenciales.

 

8. Fecha de iniciación y terminación:

Del 28/04/2023 al 30/06/2023.

 

9.  Carga horaria total y cronograma tentativo:

     80 horas totales, repartidas en 60 horas presenciales y 20 horas no presenciales. 

 

10. Cupo mínimo - máximo:

Cupo mínimo: cinco (5) asistentes.

Cupo máximo: cuarenta (40) asistentes.

 

11. Fundamentación / Objetivos:

En el presente curso se pretende dotar a los cursantes de un paquete de herramientas básicas que disponemos en el laboratorio de histología para identificar estructuras y moléculas en los tejidos con la finalidad de abordar un diagnóstico de certeza.

En el estudio de los diferentes sistemas que conforman el organismo animal, pueden utilizarse diversas técnicas dependiendo de los aspectos que deseen abordarse en el mismo. Así, si se pretende conocer la estructura de órganos, tejidos o células se pueden emplear técnicas convencionales de microscopía óptica o electrónica. Las mismas pueden desarrollarse a partir de muestras convencionales para procesamiento histológico o también desde muestras obtenidas por punción exploratoria. Cuando deseamos conocer el comportamiento de estos sistemas en sus distintos niveles podemos aplicar un sinnúmero de pruebas bioquímicas y ensayos biológicos que permiten caracterizar funcionalmente a los mismos. 

Sin embargo, existen técnicas que combinan los resultados potenciales de las anteriores permitiéndonos obtener una aproximación morfofuncional integrada, a través de la localización en células o tejidos de moléculas específicas. Estas técnicas son conocidas en general como técnicas histoquímicas, las cuales constituyen una disciplina de frontera entre la histología y la química analítica. A partir de estas técnicas se pueden identificar un sinnúmero de sustancias que pueden estar presentes en las células y tejidos. Particularmente, las técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas (IHQ) permiten localizar moléculas específicas en base a su composición y estructura tridimensional.

 Desde sus comienzos en la década del cuarenta, la IHQ se ha convertido en una de las herramientas más útiles en la investigación básica y aplicada de las células y tejidos, así como también en el diagnóstico de patologías celulares, especialmente en los últimos diez años.

 Toda sustancia o estructura celular o tisular con capacidad antigénica es susceptible de ser demostrada in situ mediante técnicas IHQ.

 Estas técnicas se basan en la identificación de antígenos celulares o tisulares por medio de la interacción con un anticuerpo (Ac) específico. El sitio de unión del Ac puede ser determinado ya sea por el marcaje directo del Ac o a través del uso de un método de marcaje secundario. Las técnicas IHQ son de amplia aplicación en investigación biomédica, así como en el diagnóstico de patologías en humanos y animales.

 Finalmente, el desarrollo de los contenidos de citología nos permitirá conocer las distintas estirpes celulares que pueden estar presentes en las punciones (aspiraciones) con aguja fina, improntas e hisopados y su potencial diagnóstico, con particular énfasis en el desarrollo de la citología vaginal exfoliativa, técnica que se ha desarrollado en caninos durante décadas en nuestras cátedras y actualmente ampliando a otras especies a través de nuevos proyectos de investigación.

 

Al finalizar el curso se pretende que los asistentes logren:

?                Brindar conocimientos en la correcta toma de muestras para estudios a microscopía óptica.

?                Adquirir destrezas en las técnicas básicas de procesamiento histológico sobre la base de un sólido conocimiento teórico.

?                Desarrollar habilidades para la selección de técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas.

?                Conocer los fundamentos y procedimientos de la citología como herramienta diagnóstica.

 

 

 

12. Programa del curso: 

Contenidos Teóricos: 

1.              Toma de muestras. 

Nociones básicas de bioseguridad en los laboratorios. Diferentes técnicas para la observación de células y tejidos. Toma de muestras para histología: elementos y condiciones para su obtención.  Consideraciones particulares para la toma de muestras para histoquímica e inmunohistoquímica. Fijación: Concepto y modo de acción. Características generales de fijadores (utilidad, duración de la fijación, temperatura, etc.). Tipos de fijadores más utilizados en histología. Clasificación. Tamponado. Utilización del protocolo en el envío de muestras. Criterios de rechazo en las muestras. 

2. Procesamiento de muestras.

2.1. Rotulado de muestras. Procesamiento en el laboratorio: deshidratación, aclaración e inclusión: Fundamento, características y reactivos utilizados. Instrumental y aparatos necesarios. Confección del taco o bloque. Orientación de las muestras.  Corte: Concepto y finalidad. Tipos de micrótomos, ventajas y desventajas de la utilización de cada uno. Colado. Técnicas para el estudio del hueso: por desgaste y descalcificación.  

2.2. Colorantes: concepto, clasificación, y fundamentos en una coloración. Acidofilia y basofilia. Metacromasia. Montaje: Finalidad, tipos de medios y su utilización.  Características generales. 

3. Histoquímica.

3.1. Principios generales. Técnicas para la visualización de hidratos de carbono, lípidos, pigmentos, ácidos nucleicos, etc.  Selección y utilización para cada caso.

4. Inmunohistoquímica.

4.1. Introducción a las técnicas inmunohistoquímicas. El objetivo de la histoquímica. La histoquímica en el laboratorio. Enzimo-Histoquímica. Principios. Inmunohistoquímica.

4.2. Recuperación antigénica. Fundamentos. 1- Métodos físicos: tipos, procedimiento, ventajas y desventajas. Tampones de recuperación. 2- Método enzimático: tipos, procedimiento, ventajas y desventajas. Recuperación antigénica y su uso en los inmunomarcajes dobles.

4.3. Reactivos básicos. Anticuerpos: Introducción. Inmunoglobulinas. Anticuerpos policlonales y monoclonales. Afinidad de anticuerpos. Reacción cruzada. Estabilidad de anticuerpos. Manipulación. Marcadores: Enzimas: peroxidasa y fosfatasa alcalina. Metales coloidales. Marcadores fluorescentes: isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato tetra metil rodamina. Radioisótopos.

4.4.Técnica inmunohistoquímica. Inmunohistoquímica Básica
Concentración de anticuerpos. Dilución. Incubación: tiempos y tipos. Anticuerpos secundarios. Substratos y cromógenos. Sistemas de visualización.
Métodos Inmunohistoquímicos Técnicas inmunoenzimáticas: 1- Métodos directos: técnica tradicional, técnica EPOS. 2- Métodos Indirectos: técnica tradicional, técnica de anticuerpos no conjugados, técnicas Avidina-Biotina, sándwich de hapteno, técnicas basadas en polímeros.

4.5. Controles. Introducción. Controles positivos y negativos: su importancia, utilización y tipos.

4.6. Dificultades en el inmunomarcaje. Bloqueo de la actividad enzimática endógena de los tejidos: peroxidasa, fosfatasa alcalina. Bloqueo de la actividad de la biotina endógena de los tejidos. Sustratos para peroxidasa y fosfatasa alcalina. Tinción inespecífica de fondo (Background). Supresión del Background. Tinción inadecuada.

5. Citología

5.1. Introducción a la citología diagnóstica. Ventajas e inconvenientes de la técnica. Cuando utilizar una citología. Toma de muestras: Dificultades en su obtención: Cómo minimizar las mismas. Técnicas utilizadas: Aspiración con aguja fina (AAF). Aguja fina. Improntas. Hisopos. Cinta de acetato. Cómo, cuándo y dónde utilizar cada técnica. Procesado de las muestras: Método de extendido. Método del Squash. Método de Rodar. Método para Improntas. Método para Hisopados.

5.2. Tinciones. Tipos y usos. Problemas y soluciones. Envío de muestras: Cuándo y cómo enviar una muestra al laboratorio. Evaluación de una citología: Examen a pocos aumentos. ¿Qué y cómo evaluamos una citología a 4X?  Examen a medianos aumentos. ¿Qué y cómo evaluamos una citología a 10X?  Examen a altos aumentos. ¿Qué y cómo evaluamos una citología a 40X?  Cuándo utilizar el 100X.

5.3. Reconocimiento del origen celular. Células Inflamatorias: Repaso de las principales características estructurales y ultraestructurales que permiten reconocer las principales células inflamatorias que podemos valorar en una muestra citológica. Neutrófilos, Linfocitos, Plasmocitos, Eosinófilos y Macrófagos. Células tisulares: Repaso de las principales características estructurales y ultraestructurales que permiten reconocer en una muestra citológica las diferentes estirpes celulares. Epitelial. Mesenquimático y de células redondas. Criterios de malignidad celular: Poblacionales, nucleares y citoplasmáticos. Cómo valora cada uno.

5.4. Citología vaginal. Fisiología hormonal. Ciclo estral de la hembra canina. Cambios del epitelio vaginal durante el ciclo estral. Toma de muestra para citología vaginal, frotis, coloración, envío al laboratorio. Células normales encontradas en un frotis vaginal. Células parabasales, células intermedias profundas, células intermedias superficiales, células superficiales, escamas celulares, células espumosas y células metaestrales. Relación del tipo celular y el ciclo estral de la hembra canina.

 

Contenidos Prácticos:

1.   Realización de toma de muestras para histología. Fijación: Preparación del fijador (formaldehído): cálculo de volumen y concentración. Preparación del taco. Confección de un protocolo de envío de muestras.

2. Corte y colado. Coloración: procedimiento para una coloración de rutina (hematoxilina y eosina), y técnicas especiales (argénticas, PAS, orceína, Alcian blue, Tricrómica de Masson). Montaje. 

3. Reconocimiento y manejo del instrumental necesario para el desarrollo de las técnicas IHQ. Preparación de buffers de lavado y recuperación. Dilución de Anticuerpos. Desarrollo de la técnica IHQ: utilización de diferentes métodos de desenmascaramiento antigénico, empleo de anticuerpos monoclonales y policlonales. Controles positivos y negativos. Lectura e interpretación de resultados. Toma de microfotografías.

4. Práctico de células inflamatorias: Repaso de las principales características estructurales y ultraestructurales que permiten reconocer las principales células inflamatorias que podemos valorar en una muestra citológica. Neutrófilos, Linfocitos, Plasmocitos, Eosinófilos y Macrófagos. Práctico de estirpes celulares. Resolución de casos de citología y toma de muestra (sujeto a la presencia de casos clínicos)

5. Práctico de toma de muestra para citología vaginal, coloración, identificación de tipos celulares. Presentación de casos clínicos y discusión. Informe citológico.

 

13. Condiciones de aprobación:

75% de asistencia y evaluación final aprobada. Esta última consistirá cada participante deberá seleccionar una de las técnicas diagnósticas utilizadas y ejecutada en los prácticos de laboratorio para exponer los resultados obtenidos con su aplicación.

 

14. Población objetivo:

Médicos Veterinarios de universidades públicas o privadas, nacionales o extranjeras.

 

15. Bibliografía:

1.              Anderson, G. & Gordon, K.C. 1999. Tissue processing, microtomy and paraffin sections. En: Theory and practice of histological techniques. Bancroft, J.D. & Stevens, A. Ed. 4º Ed. Harcourt Pub. 47-67.

2.              Bancroft, J.D, Stevens, A, Turner, D.R. 1996. Theory and practice of histological techniques. Fourth Edition. Churchill Livingstone: Edimburgo. 766 p.

3.              Boenisch, T. 2006. Heat-induced antigen retrieval: what are we retrieving? J Histochem Cytochem. 54:961-4.

4.              Carlton, S. 1999. Immunofluorescent techniques. En: Theory and practice of histological techniques. Bancroft, J.D. & Stevens, A. Ed. 4º Ed. Harcourt Pub. 421-434.

5.              Cowell R.L.; Tyler R.D.; Meinkoth J.H. 1999. Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. Second Edition. Editorial: MOSBY. 

6.              D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. 2009. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. J Immunol Methods. 341:1-18. 

7.              Dunn J. 2014. Manual of Diagnostic Cytology of the Dog and Cat. Editorial: WILEY BLACKWELL.

8.              Hopwood, D. 1999. Fixation and fixatives. En: Theory and practice of histological techniques. Bancroft, J.D. & Stevens, A. Ed. 4º Ed. Harcourt Pub. 23-45.

9.              Kämmerer, U., Kapp, M., Gassel, A.M., Richter, T., Tank, C., Dietl, J., Ruck, P. 2001.A new rapid immunohistochemical staining technique using the EnVision antibody complex. J Histochem Cytochem.49:623-630.

10.           Kiernan, J.A. (1990). Histological and histochemical methods. Theory and practice. Kiernan, J.A. (ed.). Second edition. Pergamon Press: Oxford. 433 pp.

11.           Luna, L.G. 1974. Manual of histological staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3° Ed. McGraw-Hill, Nueva York. 258 p.

12.           Marcaccini Carpio, A., Sardón Ruiz, D. 2020. Citología Veterinaria Práctica: del reconocimiento celular al diagnóstico. La voz de la verdad, Madrid. 279 pp.

13.           Miller, K. 1999. Immunocytochemical techniques. En: Theory and practice of histological techniques. Bancroft, J.D. & Stevens, A. Ed. 4º Ed. Harcourt Pub. 435-470.

14.           Raskin R.E. y Meyer D.J. 2010 Canine and Feline Cytology a Color Atlas and Interpretation Guide. Editorial: ELSIEVER. 

15.           Rodrigo, J., Bentura, M.L., Peinado, M.A., Fernández, A.P., Pedrosa, J.A., Aránega, A.E., Martínez de Velasco, J. & Martínez-Murillo, R. 1996. Tinciones histológicas básicas usadas para contratinciones en inmunocitoquímica. En: Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Peinado, M.A., Pedrosa, J.A. & Rodrigo, J. Eds. Jaén, Universidad. 107-128.

16.           Rodrigo, J., Pedrosa, J.A., Peinado, M.A., Esteban, F.J., Fernández, A.P., Bentura, M.L., Martínez de Velasco, J. & Martínez-Murillo, R. 1996. Fijadores más usuales empleados en inmunocitoquímica. En: Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Peinado, M.A., Pedrosa, J.A. & Rodrigo, J. Eds. Jaén, Universidad. 61-79.

17.           Rodrigo, J., Thompson, R.P., Peinado, M.A., Esteban, F.J., Fernández, A.P., Sánchez, E., Pedrosa, J.A., Bentura, M.L. & Martínez-Murillo, R. 1996. Preparación de los tejidos y sistema de corte. En: Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Peinado, M.A., Pedrosa, J.A. & Rodrigo, J. Eds. Jaén, Universidad. 81-106.

18.           Roitt, I. 1998. Técnicas celulares. En: Inmunología Fundamentos. 9º Ed. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. 132-151.

19.           Uttenthal, L.O., Ghiglione, M. & Koch, C. 1996. Producción de anticuerpos monoclonales. En: Avances en inmunocitoquímica y técnicas relacionadas. Peinado, M.A., Pedrosa, J.A. & Rodrigo, J. Eds. Jaén, Universidad. 17-29.

 

16. Arancel: 

El curso tendrá un costo de 400 GAVET institucionales para residentes en el país y de U$ 550 (quinientos cincuenta dólares estadounidenses) para extranjeros. 

16.1. Presupuesto:

En el caso de que no se logre financiamiento a través de programas como el PRODOC, los docentes del curso renuncian a percibir honorarios por el dictado del mismo, a los fines de reducir los costos y permitir que la inscripción de los docentes de las cátedras de Histología I y Embriología Básica e Histología II y Embriología Especial sea gratuita. Los insumos de laboratorio para histoquímica e iinmunohistoquímica presentan costos muy elevados y los precios están dolarizados por lo que la totalidad de lo recaudado será destinado a cubrir costos básicos de reposición parcial de insumos. 

16.2.- Modalidad de inscripción

Los interesados deberán inscribirse en la Secretaría de Estudios de Postgrado y Educación 
inscripcionesposgrado@fcv.unr.edu.ar